抗猪瘟转基因动物模型的建立

2019-03-14 02:58:11 来源: 漯河信息港

养殖业的发展,使畜禽数量增加,生产性能提高,但畜禽传染病日趋严重,常规防疫措施有时无能为力。为此该研究承担 “863”项目,开展了基因工程抗病育种的探索。对象是危害的猪瘟,采用的技术路线是核酶(Riboayme)阻断病毒基因表达的机制。首先分析我国猪瘟病毒保守基在P80和411个核苷酸(nc)序列,发现我国石门毒与国外毒株在41Int的区段中,同源性高达91.50%~96.60%,并且有20个nt长的区段作为核酶的靶区。针对该靶区设计并合成了核酶基因,构建了体外和体内表达载体,并经酶切和序列测定,证明合成的基因、构建的载体与预期的设计相符。将体外表达的核酶分子与猪瘟病毒RNA混合于试管内作用后,病毒RNA分子被切成了预期的两个片段。

体外证明所合成的核酶基因具有活性,将该基因用磷酸钙沉淀法导入PK50传代细胞,获得了抗猪瘟病毒感染能力提高60.2%细胞克隆。经细胞功能验证后,又将含核酶基因的重组质粒用显微注射导入家兔受精卵原核。前后共注射444枚受精卵,移植30只受体兔,

抗猪瘟转基因动物模型的建立

获98只后代,经PCR和Southern杂交检测,其中有6只仔兔整合了导入的核酶基因。为了检测转基因兔的实际抗病毒性能,对其中4只接种了100个RID50C株病毒,观察体温反应。结果 1只动物体温完全正常, 1只仅有0.5℃以下的体温上升,2只温度上升不超过1℃。而对照兔和经过转基因但未整合的兔均有212以上的体温上升,并呈现典型稽留热,说明这4含核菌基因的家兔完全或部分抗住了猪瘟病毒感染。将4只抗病毒转基因兔剖杀,取肝脏用RT—PCR和Northern杂交检测,在2只兔肝细胞中检出了外源基因表达的核酶RNA。进一步佐证了外源基因在兔体内表达并阻断了病毒复制。

上述结果证明,我们针对猪瘟病毒设计合成的核酶基因能够表达出在试管水平上特异性剪切猪瘟病毒RNA分子,也能够在细胞培养水平和动物个体水平上阻断猪瘟病毒复制。从而为抗猪瘟转基因猪培育提供了数据,做了前期技术准备。

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